FRET（熒光共振能量轉(zhuǎn)移）

熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET) 是一種在分子尺度上表征距離相關(guān)相互作用的強(qiáng)大技術(shù)。它是為數(shù)不多的能夠測(cè)量體內(nèi)和體外分子間和分子內(nèi)距離相互作用的工具之一. FRET 涉及通過其吸收光譜內(nèi)的入射光激發(fā)供體熒光團(tuán)。這種輻射吸收將供體熒光團(tuán)提升到更高能量的激發(fā)態(tài)，該激發(fā)態(tài)通常會(huì)以特征發(fā)射光譜輻射衰減（返回基態(tài)）。如果另一個(gè)熒光團(tuán)分子（受體）存在于供體附近，其能量狀態(tài)的特征是吸收光譜與供體的發(fā)射光譜重疊，則供體和受體之間存在非輻射能量轉(zhuǎn)移的可能性。圖1顯示了青色熒光蛋白（CFP）發(fā)射光譜和黃色熒光蛋白（YFP）吸收光譜的重疊；這對(duì)支持強(qiáng)大的 FRET 相互作用。

圖 1：CFP（供體）和 YFP（受體）吸收和發(fā)射光譜。

CFP 發(fā)射和 YFP 吸收（陰影區(qū)域）之間的重疊導(dǎo)致有效的 FRET 相互作用。

***能量轉(zhuǎn)移由供體和受體熒光團(tuán)分子之間的偶極-偶極相互作用（范德華力）介導(dǎo)，其變化為兩個(gè)分子之間距離的倒數(shù) 6 次方。從供體到受體的能量轉(zhuǎn)移速率大約為 k_F     k_F~k_D(r₀/r)⁶

其中 k_D是供體熒光團(tuán)的輻射衰減率，或在沒有受體熒光團(tuán)的情況下熒光發(fā)射壽命的倒數(shù)（通常為 1 – 50 ns），r 是兩個(gè)分子之間的距離， r₀
是“"Förster距離”，表征能量傳輸?shù)?50% 效率點(diǎn)。FRET 適用于測(cè)量 FRET is suited to measuring changes in Förster 距離數(shù)量級(jí)的距離變化，通常為 20 到 90 Å.

在能量從供體轉(zhuǎn)移到受體后，受體熒光團(tuán)被激發(fā)到其熒光發(fā)射狀態(tài)。因?yàn)閺氖荏w觀察到的熒光發(fā)射速率受從供體到受體的能量轉(zhuǎn)移的速率限制，所以 FRET 發(fā)射的定量測(cè)量可以使用上述方程提供距離的推斷測(cè)量。準(zhǔn)確的 FRET 測(cè)定通常涉及比較有和沒有受體存在的樣品中的供體和供體-受體熒光發(fā)射強(qiáng)度。比率測(cè)量是必要的，因?yàn)槿鐖D 1 所示，供體和受體發(fā)射光譜之間通常存在重疊，因此，很難通過單次測(cè)量準(zhǔn)確確定使用受體發(fā)射濾光片測(cè)量的熒光的哪一部分僅來自受體。熒光壽命測(cè)量為能量轉(zhuǎn)移率提供更直接的結(jié)果，不易受濃度變化的影響，并且可以使用時(shí)域或相位調(diào)制壽命測(cè)量技術(shù)進(jìn)行。 

FRET 應(yīng)用通常以非常低的分子熒光團(tuán)濃度為特征。使用精心優(yōu)化的濾光片對(duì)于檢測(cè)微弱的熒光發(fā)射信號(hào)至關(guān)重要。Semrock BrightLine® 熒光濾光片提供盡可能高的透射率，以最/大化 FRET 發(fā)射信號(hào)，以及精心優(yōu)化的透射通帶深度阻擋，以實(shí)現(xiàn)最大可能的信號(hào)背景比（最高對(duì)比度）。

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圖 2：用于定量測(cè)量供體發(fā)射的 CFP 激發(fā)片、二向色和發(fā)射片（來自 BrightLine FRET-CFP/YFP-A 濾光片組）

圖 3：帶有 YFP 發(fā)射濾光片（來自 BrightLine FRET-CFP/YFP-A 濾光片組）的CFP 激發(fā)片和二向色濾光片，用于受體發(fā)射的定量測(cè)量。

可以使用兩個(gè)不同的濾光片組（立方體）依次進(jìn)行這兩個(gè)測(cè)量，其中每個(gè)濾光片組（立方體）具有相同的激發(fā)濾光片和二向色濾光片，但發(fā)射濾光片不同。不推薦這種方法，因?yàn)闉V光片立方體之間的像素偏移會(huì)使測(cè)量結(jié)果失真，并且更換濾光片立方體需要相對(duì)較長的時(shí)間并導(dǎo)致樣品振動(dòng)，從而影響感興趣分子之間的距離。相反，建議使用更快速、低振動(dòng)的濾光片切換或真正同時(shí)檢測(cè)供體和受體發(fā)射，尤其是在對(duì)移動(dòng)的活細(xì)胞樣本執(zhí)行 FRET 時(shí)。對(duì)于那些選擇使用兩個(gè)單獨(dú)的濾光片立方體的人來說，選擇旨在
消除像素偏移的濾光片組很重要 以獲得最準(zhǔn)確的測(cè)量值。

使用發(fā)射濾光輪可以實(shí)現(xiàn)快速、低振動(dòng)的濾光片更換。這是用于寬視場(chǎng) FRET 測(cè)量的最常見的顯微鏡配置。一些研究人員更喜歡使用雙濾光片轉(zhuǎn)輪系統(tǒng)（一個(gè)用于激發(fā)片，一個(gè)用于發(fā)射片）的靈活性，盡管這種系統(tǒng)在軟件控制方面更昂貴且更復(fù)雜。對(duì)于雙濾光片轉(zhuǎn)輪系統(tǒng)，最/好/的濾光片組選擇是 Sedat 多波段組。最后，還可以使用兩個(gè)攝像頭同時(shí)檢測(cè)供體和受體發(fā)射通道。一些制造商為此應(yīng)用制造顯微鏡附件。除了標(biāo)準(zhǔn)的 FRET 濾光片組外，還需要一個(gè)額外的二向色分束鏡來分隔附件中的兩個(gè)發(fā)射路徑。

熒光濾光片簡介

一個(gè)分子吸收其吸收譜帶波長范圍（即吸收光譜）內(nèi)的光，然后幾乎瞬間發(fā)出較長的、位于其發(fā)射譜帶波長范圍（即發(fā)射光譜）內(nèi)的光，此時(shí)，就會(huì)發(fā)生光學(xué)熒光。為了達(dá)到分析的目的，強(qiáng)的熒光分子，亦被稱為熒光團(tuán)、熒光染料，專門用于連接到生物分子或其他感興趣的目標(biāo)，用于鑒定、定量、甚至實(shí)時(shí)觀察物質(zhì)的生物和化學(xué)活性。熒光染料因?yàn)榫哂?的靈敏度、高特異性和簡單性，被廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)和分析檢測(cè)中。大多數(shù)熒光儀器，包括熒光顯微鏡，都是基于光學(xué)濾光片。

一個(gè)典型的系統(tǒng)有三個(gè)基本的濾光片組成：激發(fā)濾光片（或吸收濾光片），二向色鏡分束鏡（或二向分色鏡）和發(fā)射濾光片（或阻擋濾光片）。激發(fā)濾光片通常是一個(gè)帶通濾光片，它只透過熒光染料的吸收波長，從而最大限度地減少熒光的其他來源的激發(fā)光和阻擋熒光發(fā)射帶內(nèi)的激發(fā)光。二向色鏡分束鏡是一種邊緣濾光片，用于斜角入射 （通常是 45 °），以有效地反射激發(fā)波段的光和透射發(fā)射波段的光。Semrock 發(fā)射濾光片通常是一個(gè)帶通濾光片，僅透過熒光染料的發(fā)射波長，并阻擋這個(gè)波段之外的所有不需要的光 - 尤其是激發(fā)光。通過濾光片阻擋不需要的激發(fā)能量（包括紫外和紅外）或樣品和系統(tǒng)的自發(fā)熒光，就可以得到具有黑暗背景的熒光圖像。

我們可以通過選擇適當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)濾光片，組成一個(gè)濾光片組，用于觀察熒光或者對(duì)熒光進(jìn)行成像，這樣就可以達(dá)到使一個(gè)給定的熒光染料可視化的目的。因?yàn)椴煌瑹晒馊玖系募ぐl(fā)光譜和發(fā)射光譜不同，濾光片組需要優(yōu)化，才可以用于不同熒光染料的同時(shí)成像。在不同的實(shí)驗(yàn)條件下使用同一個(gè)熒光染料時(shí)，濾光片組也需要優(yōu)化。